L'Electrophorèse
Etant dans l’incapacité de réaliser l’expérience de l’électrophorèse au sein de notre lycée, nous allons donc la décrirer.
Lors d’une enquête criminelle, la police scientifique effectue une extraction et une électrophorèse sur une molécule d’ADN relevée sur la scène du crime et sur une molécule d’ADN d’un ou plusieurs suspects.
L’électrophorèse est une technique utilisée pour séparer et caractériser les molécules, cette séparation s’effectue en fonction de la taille et de la charge des molécules.
Lorsque l’on analyse une molécule d’ADN, on peut constater que seules les parties « phosphatées » sont chargées, qui plus est, chargées négativement.
Une fois la molécule mise en présence d’un courant électrique (dans la cuve à électrophorèse), elle va migrer de la borne négative vers la borne positive.
La vitesse de migration dépendra de la taille des fragments.
Nous savons que les enzymes de restrictions coupent l’ADN à des endroits bien précis, chaque individus est donc unique.
Les différentes tailles des fragments d’ADN permettent une migration disproportionnelle selon les tailles .L’identification s’effectue ensuite en comparant les distances de migration.
O Préparation du Tampon TBE :
- 100 mL de Tampon TBE à pH 8,3
- 900 mL d’eau distillée
Mélanger la solution, on obtient donc 1000 mL de Tampon TBE
O Préparation du gel de migration :
0,8g de gel d’agarose pour 100mL de Tampon TBE qu’il faut mélanger dans un erlenmeyer.
Placer ensuite la solution pendant 2 à 3 minutes au micro-ondes à 1000 W de puissance.
Le gel doit faire 4 à 5 mm d’épaisseur.
Il ne reste plus qu’à couler le gel, refroidit aux alentours de 55°C, dans un moule composé d’un peigne qui déterminera les puits de dépots.
O Préparation de l’ADN
Chez certains fournisseurs, la solution d'ADN est prête à l'emploi, il est donc préférable d'opter pour cette solution.
O Préparation de la cuve à électrophorèse :
Placer le gel (toujours sur son support) dans la cuve : le puits devra être placé du côté de la cathode (-).
Remplir ensuite la cuve avec le Tampon TBE, jusqu’à ce que le niveau soit au ras du gel, le Tampon TBE NE DOIT PAS RECOUVRIR LE GEL.
O Protocole expérimental :
Placer les échantillons d’ADN dans des tubes à essais, introduire des enzymes de restriction, une enzyme de restriction différente pour chaque tube.
Ajouter ensuite le bleu de bromophénol (colorant). Ce colorant permettra de suivre l’avancement de la migration de l’électrophorèse.
Déposer 10uL de la solution d’ADN au fond de chaque puits
-> Mettre en route l’électrophorèse.
O Mise en route de l’électrophorèse :
Fermer la cuve, brancher les fils, puis mettre sous courant.
Tension constante de 100 V pendant la durée de l’électrophorèse.
Vérifier qu’il y a apparition de buée lors des 5 premières minutes pour s’assurer que l’électrophorèse a bien débuté.
Une fois l’électrophorèse terminée, récupérer le gel dans son support.
O Révélation des bandes d’ADN
Manipuler le gel délicatement car très fragile !
Plonger le gel pendant 20 minutes dans la solution de coloration.
Transférer le gel dans un cristallisoir rempli d’eau tiède, puis changer d’eau de temps en temps, poursuivre cela jusqu’à la décoloration du fond.
Les bandes d’ADN apparaissent alors en bleu foncé !
La prochaine étape est l'identification !